产品货号：
BTN100903
中文名称：
AFLP试剂盒(EcoRI-MseI)
英文名称：
AFLP Kit(EcoRI-MseI)
产品规格：
1600次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品在传统AFLP-PCR的基础上经过精心优化而开发。AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一种结合RFLP和PCR技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术。
- 一站式，足够50次酶切-连接反应、50次预扩反应和1500次AFLP PCR（30μL体系计算），但不包括DNA纯化和带型分析试剂（如PAGE电泳试剂和银染试剂）。
- 本制品提供EcoRI-MseI组合，适用于GC含量在50%以上的基因组。对GC含量在50%以下的基因组，需从本公司另外采购EcoRI-TaqI组合的AFLP试剂盒。
- 各种参数都经过优化，一次PCR所得AFLP片段数一般在10～100之间，可重复性好，误差小于0.6%。
- 本制品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb的材料（如动物和植物）。对于基因组在50-500 Mb的材料（如细菌和真菌）或50Mb以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC和PAC等），需要分别另购+0型预扩增引物对和+2型扩增引物。
- 本制品只能用于科研。
| 包装 | 成分 | 规格 |
| AFLP酶切-连接-预扩增相关成分 | 10×AFLP酶切-连接Buffer | 100μL |
| AFLP EcoRI-MseI酶混合液 | 50μL | |
| AFLP EcoRI-MseI接头干粉 | 50次 | |
| AFLP EcoRI-MseI接头溶解液 | 1mL | |
| +1型EcoRI-MseI预扩增引物干粉 | 50次 | |
| T4 DNA连接酶(5U/μL) | 50μL | |
| AFLP +3型EcoRI引物系列 | E-AAC引物干粉 | 1 OD |
| E-AAG引物干粉 | 1 OD | |
| E-ACA引物干粉 | 1 OD | |
| E-ACT引物干粉 | 1 OD | |
| E-ACC引物干粉 | 1 OD | |
| E-ACG引物干粉 | 1 OD | |
| E-AGC引物干粉 | 1 OD | |
| E-AGG引物干粉 | 1 OD | |
| AFLP +3型MseI引物系列 | M-CAA引物干粉 | 1 OD |
| M-CAC引物干粉 | 1 OD | |
| M-CAG引物干粉 | 1 OD | |
| M-CAT引物干粉 | 1 OD | |
| M-CTA引物干粉 | 1 OD | |
| M-CTC引物干粉 | 1 OD | |
| M-CTG引物干粉 | 1 OD | |
| M-CTT引物干粉 | 1 OD | |
| AFLP PCR成分 | 2×PCR MasterMix(含示踪剂) | 5mL×6 |
保存：-20℃，有效期1年。
超纯水、Southern级DNA纯化试剂，尿素-PAGE电泳套装，银染试剂盒。
一、DNA提取（本试剂盒不提供相关试剂）
- 用户需要自备50～500ng Southern级别的基因组DNA。DNA酶切彻底是AFLP成功的关键，所以最好先预实验以确保DNA能够被EcoRI和MseI内切酶彻底切开。
二、限制性内切酶酶切和DNA-接头连接反应
本试剂盒足够50次20μL体系的酶切-连接反应
- 在0.2mL离心管中设置20μL的限制性内切酶酶切反应：
成分 用量 10×AFLP酶切-连接Buffer 2μL 样品DNA 对小基因组材料 50ng 对大基因组材料 500ng AFLP EcoR I-Mse I酶混合液 1μL 自备超纯水 至20μL - 轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2小时酶切（若PCR仪器不带热盖，则必须加50μL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同）。反应结束后70℃保温15分钟灭活酶。
- 在体系中加入20μL AFLP EcoRI-MseI接头混合物和1μL T4 DNA连接酶，5U/uL，轻柔混匀并短暂离心，20℃保温3小时让接头跟酶切DNA片段连接。第一次使用本试剂盒时，需要把本试剂盒提供的1mL AFLP EcoRI-MseI接头溶解液加入到AFLP EcoRI-MseI接头干粉管，涡旋震荡半分钟，短暂离心，然后再取用。没有用完的需要放-20℃保存。
- 反应结束后直接在40μL的连接反应体系中加入自备360μL超纯水，得到连接液10倍稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。
三、预扩增
本试剂盒足够40次30μL体系的预扩增反应
- 在0.2mL离心管中设置30μL的预扩PCR体系。首次使用本试剂盒时，需要在本试剂盒提供的+1型EcoRI-MseI预扩增引物干粉管中加入100μL自备超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，短暂离心后直接取用。没有用完的部分，需要放-20℃保存：
成分 用量 连接液10倍稀释液（来于第4步） 5μL +1型EcoRI-MseI预扩增引物 10μL 2×PCR MasterMix 15μL - 离心数秒，按下列参数进行PCR预扩增（注意：第一步是预合成，跟常规PCR不同）：预合成72℃ 2分钟，PCR循环20次（94℃30S，56℃60S，72℃60S）
- 取10μL PCR产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物应为大小在100～1500bp的模糊条带。本试剂盒的2×PCR MasterMix含上样液和示踪染料，故不需要额外加Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于50bp的DNA片段。
- 在剩下的20μL预扩增反应液中加入980μL自备超纯水，相当于稀释50倍，所得50倍PCR模板稀释液将直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。
四、选择性PCR扩增
- 制备引物：在本试剂盒提供的8只+3型EcoRI引物干粉和8只+3型MseI引物干粉中，每管分别加入1100μL自备超纯水，震荡混匀得16管引物母液。每管取66μL引物母液与1034μL超纯水在1.5mL离心管中混合得1100μL每个引物的相应工作液，共16管引物工作液。
- 在0.2mL PCR管中，加入下列成分（第一次PCR时需要测试所有8×8=64种引物组合，需设置64个PCR反应。若已知哪个一种或几种引物组合适合，则可以直接使用选中的引物），下面以一种+3型EcoR I引物和+3型Mse I引物组合为例：
成分 用量 50倍PCR模板稀释液 5μL AFLP+3型EcoR I引物工作液（八种之一） 5μL AFLP+3型Mse I引物工作液（八种之一） 5μL 2×PCR MasterMix 15μL - 轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：
过程 温度 时间 PCR 13次循环 94℃ 30秒 65℃ 30秒（每次循环递减0.7℃） 72℃ 60秒 PCR 23次循环 94℃ 30秒 55℃ 30秒 72℃ 60秒 延伸 72℃ 5分钟
五、尿素-PAGE电泳和银染
注：需另购试剂并按相关手册进行
- PCR结束后进行尿素-PAGE电泳和银染分析，本试剂盒不含相关试剂。
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